細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司-杭州細(xì)胞實(shí)驗(yàn)-南京英瀚斯生物科技

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢-建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢-包裝：公司使用3質(zhì)粒慢-包裝系統(tǒng)，慢-系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過(guò)表達(dá)慢-系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢-顆粒純化試劑盒將慢-純化。純化后留取部分檢測(cè)-滴度，其余-凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測(cè)：將-顆粒使用梯度稀釋?zhuān)�分別293t細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算-滴度。

細(xì)胞：在-前-對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋-，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，-數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的moi加入（若無(wú)moi，需做-梯度：1，5，10，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞），6h后去除含-溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包費(fèi)用，使用定量pcr和western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢-質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞--收集--純化--滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 a -滴度檢測(cè)；b 目的細(xì)胞-效果圖

平板克l隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟::

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰 蛋白酶-并吹打成單個(gè)細(xì)胞，杭州細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛的dmem培養(yǎng)液中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋?zhuān)�每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10ml 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37團(tuán)5% co2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%-固定細(xì)胞5ml固定15分鐘。然后去固定液，加適量gimsa應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的數(shù)。后計(jì)算形成率。形成率= (數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) x100%平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞- -定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。