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大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
方法:分離大鼠主動(dòng)脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包,免yi組化ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出,7天即融合成片.-傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長(zhǎng),鋪路石狀,ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過(guò)90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,凍存細(xì)胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.
-檢測(cè)
本公司應(yīng)用mtt比色法, 檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。其檢測(cè)原理為huo細(xì)胞內(nèi)線粒體中的-脫氫酶能催化外源性無(wú)色的mtt形成藍(lán)色的結(jié)晶formazan,并沉積在細(xì)胞中,而-無(wú)此功能。二jia基-(dmso)能溶解細(xì)胞中的formazan,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選,用酶聯(lián)mian疫檢測(cè)儀在一定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,可間接反映huo細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、-的抗腫liu藥wu篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、以及腫liu放she敏感性測(cè)定等。服務(wù)內(nèi)容 1. 細(xì)胞接種:收到客戶細(xì)胞后,我們會(huì)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞,得出細(xì)胞懸液濃度。計(jì)算出應(yīng)稀釋的倍數(shù),按mtt試劑盒要求在96孔板內(nèi)接種 相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液;
2. 細(xì)胞培養(yǎng):然后在無(wú)菌恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)接種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,并實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài);
3. yao物處理并呈色:按不同濃度梯度加入yao物作用細(xì)胞;
4. 溶解,比色:加入mtt檢測(cè)試劑,按操作要求孵育相應(yīng)時(shí)間,在mei標(biāo)儀內(nèi)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光值。并處理數(shù)據(jù)得出比色結(jié)果。
1、操作步驟 [方法一]:
(1) 細(xì)胞培養(yǎng):取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿),向每孔中加入 2 ml 含 1~2×105 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液,37℃ co2 培養(yǎng)至 40%~60% 匯合時(shí) (匯合過(guò)分,轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。
(2) 轉(zhuǎn)染液制備:在聚-乙稀管中制備以下兩液 (為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)a 液:用不含培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg dna,終量 100μl,b 液:用不含培養(yǎng)基稀釋 2-50 μglr,終量 100μl,輕輕混合 a、b 液,室溫中置 10-15 分鐘,稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 lr 或 dna 濃度過(guò)高所致,應(yīng)酌情減量)。
(3) 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用 2 ml 不含培養(yǎng)液漂洗兩次,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司,再加入 1 ml 不含培養(yǎng)液。
(4) 轉(zhuǎn)染:把 a/b 復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,細(xì)胞實(shí)驗(yàn),搖勻,37℃ 溫箱置 6~24 小時(shí),吸除無(wú)轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。
注意:轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加,對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
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