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  全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mrna和各種noncoding rna。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化且十分復(fù)雜的分子作用網(wǎng)絡(luò)，如果只是對(duì)某個(gè)單一rna分子的研究，有時(shí)并不能準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)分子作用機(jī)制。而競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源rna(cerna)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：cerna（包括lncrna、circrna、mrna、假基因等）分子能夠通過(guò)mirna應(yīng)答元件（microrna respe element， mre）競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合相同的mirna來(lái)調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平。舉個(gè)例子：mirna會(huì)導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncrna競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了mirna，從而影響了mirna基因沉默功能實(shí)現(xiàn)。

      cerna是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的-內(nèi)容之一，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述cerna的分子作用機(jī)制。目前對(duì)全轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)便的方法就是構(gòu)建2個(gè)測(cè)序-分別進(jìn)行測(cè)序。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mrna、lncrna、circrna、mirna各自的研究?jī)?nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、cerna網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種rna聯(lián)合起來(lái)分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。去除rrna的鏈特--，含有的rna信息含量十分豐富，通過(guò)測(cè)序和生物信息學(xué)分析能夠得到mrna、lncrna、circrna的鑒定及注釋信息。不過(guò)該-構(gòu)建時(shí)會(huì)進(jìn)行片段化選擇從而濾掉了small rna的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個(gè)small rna-，進(jìn)行測(cè)序分析后可以得到mirna和其他small rna的鑒定及注釋信息。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方案路線圖如下所示：

rna提取

1.棄去培養(yǎng)液，用pbs清洗兩次1-2。

2.棄去pbs，用1000u1槍吸干凈殘余pbs。

3.加1ml trizol研磨b 41。

4. 1.5miep管標(biāo)號(hào)與每孔相對(duì)應(yīng)備用。

5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的 ep管。

6.往每個(gè)ep管中加入250ul，劇烈震蕩30s，熒光定量pcr， 冰上靜置12min[問(wèn)l。

7. 所有樣品4c離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時(shí)間: 15min.

8. 再次標(biāo)記一批同樣編號(hào)ep管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號(hào)的ep管中，再加入400ul異充

分混勻。4c冰箱35min。

10. 4c離心，pcr，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時(shí)間: 10min.

11.棄去.上清液，加1m175%-，輕搖7]。

12. 4c離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測(cè)濃度。

組織rna提取

1、剪米粒大小組織塊放入ep管中標(biāo)號(hào)。

2、ep管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。