ip-wb活性檢測試劑盒-武漢紐斯特

試劑制備

1x assay/lysis buffer：實驗前用去離子水將5x的assay/lysis緩沖液稀釋成1x的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mm pmsf， 10 μg/ml leupeptin（亮肽素），或 10 μg/ml aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細胞

1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制l劑進行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的pbs洗滌兩次。

3. 向細胞中加入1x assay/lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1ml）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組dna，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°c 12000 g， 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°c條件下。

試劑準備

?1x測定/裂解緩沖液：短暫混合5x儲備液，并在去離子水中稀釋至1x。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mm pmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。

1.將細胞（一塊10厘米長的平板，約107個細胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑-細胞。

2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的pbs洗滌兩次。

3.完全除去pbs洗滌液，然后向細胞中加入冰冷的1x分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 ml）。

4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過27?號注l射器針頭3-4次以剪切基因組dna。

8.通過離心10分鐘（在4°c下為12，000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲在冰上以立即使用，或速凍并存儲在-70°c以便將來使用。