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檢測步驟

ι�；钚詂dc42 pull-down實(shí)驗(yàn)

1. 等分0.5-1 ml的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性cdc42單克l隆抗l體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein a/g凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°c條件下孵育1h，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 ml的1x assay/lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2x sds-page樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。

gα13活化試驗(yàn)。mef細(xì)胞分別用lpa（第2道）或不加lpa（1道）處理。細(xì)胞裂解物用抗活性gα13單克l隆抗l體（cat）孵育。#26902）（頂面板）。這個(gè)用抗gα13兔多克l隆抗l體（cat）免l疫印跡法檢測沉淀活性gα13#21005年）。底部的面板顯示了用抗gα13的細(xì)胞裂解物的western blot（5%在頂部面板中使用的）。

分析原理

neweast biosciences arl1激l活檢測試劑盒基于配置特-抗arl1-gtp從細(xì)胞提取物或體外檢測活性arl1-gtp水平的單克l隆抗l體gtpγs負(fù)載arl1活化分析。簡而言之，抗活性arl1小鼠單克l隆抗l體將用含有arl1-gtp的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。然后，gao 蛋白，綁定的活動(dòng)arl1將被下拉蛋白質(zhì)a/g瓊脂糖。用抗arl1兔多克l隆抗l體或抗arl1小鼠單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析，檢測沉淀的活性arl1。

需要但未提供的材料

1-性和非-性細(xì)胞裂解物

2蛋白酶抑制素

4°c搖管器或振動(dòng)篩

40.5 m edta，ph8.0

51百萬氯-

62x還原sds-page樣品緩沖液

7電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8免l疫印跡洗滌緩沖液，如tbst（10 mm tris hcl，ph 7.4，0.15 m nacl，0.05%

吐溫-20）

9免l疫印跡阻斷緩沖液（含5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的tbst）

10pvdf或硝化纖維膜

11次級(jí)抗l體

12ecl檢測試劑

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