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武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司提供ralb 蛋白-武漢紐斯特。

陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外gtpγs/ gdp蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞-將激l活可用arf 6的大約10％，而體外gtpγs蛋白負(fù)載將激l活arf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 m edta（終濃度為20 mm）。

3，將5 μl 100 xgtpγs（至100 μm，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 x gdp（至1 mm，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°c孵育30分鐘。

6，通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2（至60 mm，終濃度）來(lái)停止加載。

1.-的和非-的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑l制劑

3. 4°c管搖桿或搖床

4. 0.5 m edta，ph8.0

5. 1 m氯-

6. 2倍還原sds-page樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如tbst（10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 m nacl，ralb 蛋白，0.05％

吐溫20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（tbst包含5％脫脂奶粉或3％bsa）

10. pvdf或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ecl檢測(cè)試劑

電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行sds-page。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到pvdf或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將pvdf膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用tbst緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%bsa在室溫下孵育1h進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用tbst緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%bsa稀釋特-識(shí)別cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°c條件下過(guò)夜孵育。

4. 用tbst緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔igg-hrp），用tbst緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%bsa按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用tbst緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如ecl顯色法。

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