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25.pcr擴增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的pcr擴增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，pcr，就是來解決pcr擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式pcr就是擴增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴增， gc含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見：
（1） rt-pcr。請注意，很多基因通過常規(guī)rt -pcr方法是很難擴增出來的。 rt- pcr成功的關(guān)鍵在于rt的反應(yīng)的rna和目標(biāo)基因在特定組織和細胞中含量。
（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組dna過高，pcr引物設(shè)計，會影響反應(yīng)體系中的mg和ph
蛋白質(zhì)雙向電泳實驗流程
1.-yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.雙向電泳分離待測樣品
(1)一相等電-前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/ml，否則會造成蛋白質(zhì)的-或沉淀。
(2)等電-完畢后(約需24hr），若不立即進行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。
(3)等電-好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%sds-page凝膠進行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5w/膠 45min，15w/膠 5-8hr，20℃。
3.銀染法對凝膠進行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗
3.凝膠掃描及圖像分析
(1)圖像掃描：凝膠染色后采用image scanner以300dpi，實時定量pcr，16-bit模式（65536灰階）進行掃描。
(2)圖像分析：掃描完畢后，熒光定量pcr，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用imagemaster 2d platinum software軟件進行分析。分析按照軟件廠商提供的說明書進行。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個重復(fù)具有相同趨勢，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點的相對一致性，至少2個重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達蛋白質(zhì)的標(biāo)準。
rna提取預(yù)備工作
rna酶（rnase）是導(dǎo)致rna降解主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些的條件下只可暫時失活，但-因素去除后又迅速恢-性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的rnase完全失活。
1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備rna時必須戴手套
2.rnase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以depc配制的70%-擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理
（1）塑料制品：盡量使用-無菌塑料制品。已標(biāo)明rnase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。
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