南京英瀚斯-細(xì)胞生物學(xué)-細(xì)胞

自噬流檢測(cè)

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話(huà)化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性-，-是、神經(jīng)退行性-及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對(duì)于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)-研究領(lǐng)域的-。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。

三、自噬過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察和檢測(cè)

1、觀(guān)察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀(guān)察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月?tīng)罨虮瓲睿�雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周期，內(nèi)含胞漿成分，細(xì)胞，如線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生-的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。無(wú)自噬時(shí)，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，gfp-lc3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用western blot檢測(cè)lc3-ii/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即lc3-id，因此，細(xì)胞生物學(xué)，lc3-ii/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: lc3對(duì)lc3-ii有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹-尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特-的。

5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特-的。