g蛋白活性檢測試劑盒-武漢紐斯特

電泳和轉(zhuǎn)移

1向聚丙l烯-凝膠（17%）中加入15μl/孔的下拉上清液。而且建議包括預(yù)染色mw標(biāo)準(zhǔn)（作為成功轉(zhuǎn)入的指標(biāo)步驟3）。

2按照制造商的說明進(jìn)行sds-page。

3按照制造商的說明，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf或硝化纖維膜上說明。

免l疫印跡檢測（所有步驟均在室溫下攪拌）

1在電印跡步驟之后，將pvdf膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室溫下干燥5分鐘。

如果使用-纖維素，則應(yīng)跳過此步驟。

2室溫下用5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在tbst中封閉1小時

不斷地攪動。

用抗arl1單克l隆抗l體孵育，g蛋白活性檢測試劑盒，新鮮稀釋1:50~1000

（取決于樣品中arl1蛋白質(zhì)的含量）5%脫脂奶粉或3%

bsa/tbst，室溫下持續(xù)攪拌1-2小時或4o

過夜。

3用tbst清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

4用二級抗l體（例如山羊抗鼠igg，hrp結(jié)合物）培養(yǎng)膜，

在室溫下，在5%脫脂奶粉或3%bsa/tbst中新鮮稀釋1:1000，1小時

不斷地攪動。

5用tbst清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

6使用您選擇的檢測方法，如ecl。

體外用gtpγs/gdp處理蛋白以用作陽性和陰性的對照

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有10%的cdc42被激l活，而在體外用gtpγs處理大約有90%的cdc42被激l活。

1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入0.5 ml的細(xì)胞提取物（如果是純的cdc42蛋白則每個管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個管中加入20ul 0.5m edta(終濃度即為20 mm)。

3. 一個管中加入5ul的100x gtpγs（終濃度即為100 um）作為陽性對照。另一個管中加入5ul的100x gdp（終濃度即為1 mm）作為陰性對照。

4. 將離心管置于30°c條件下反應(yīng)30min并不斷攪動。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(終濃度即為60mm)。