武漢紐斯特-ras (g12d)

武漢紐斯特生物科技有限公司（wuhanneweastbiotechonologyco.ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)neweastbio在的子公司。美國(guó)neweastbio-于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、elisa試劑盒、蛋白等。

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑-。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的pbs洗滌兩次。

4.完全除去pbs洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的1x分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 ml）。

5.通過(guò)重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，ras (g12d)，難以移液。如果這

   發(fā)生時(shí)，裂解液可通過(guò)27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組dna。

8.通過(guò)離心10分鐘（在4°c下為12，000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°c以備將來(lái)使用。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照的體外gtpγs/ gdp蛋白質(zhì)上樣量

    注意：體內(nèi)-細(xì)胞會(huì)激l活大約10％的可用rab35，而

    體外gtpγs蛋白負(fù)載將激l活近90％的rab35。

1.將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的rab35蛋白）。

2.向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 m edta（至20 mm終濃度）。

3.將5 μl 100 xgtpγs（至100 μm，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4.在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 x gdp（至1 mm，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5.在攪拌下將試管在30°c孵育30分鐘。

6.通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2（至60 mm）。