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蘇州博特龍免疫技術(shù)有限公司提供8周標(biāo)準(zhǔn)兔多抗制備佐劑-蘇州博特龍公司。

材料與方法

一、材料

afp購(gòu)自上海領(lǐng)潮公司。sp2／0骨0髓瘤細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。8～12周齡balb／c小鼠(第四軍0醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。spf級(jí)。

二、方法

1．動(dòng)物免0疫：將4只8～12周齡balb／c小鼠隨機(jī)分為兩組，每組2只，分別命名為1號(hào)和2號(hào)(第yi組)、3號(hào)和4號(hào)(第二組)。第yi組按常規(guī)免0疫方法進(jìn)行免0疫一…，第二組采用改良的免0疫方法進(jìn)行免0疫。免0疫前靜脈采集少量-，析出血0清作為后續(xù)檢測(cè)的陰性對(duì)照血0清。

第yi組：afp50ug(50肚1)與等量福氏完全佐劑(sigma，美國(guó))混合，充分乳化后注入8～12周齡balb／c小鼠腹腔，2周后用同量抗原加不完全福氏佐劑(sigma，美國(guó))腹腔注射，4周后用同量抗原加不完全福氏佐劑腹腔注射，融合前3 d作腹腔注射加強(qiáng)免0疫。

飼養(yǎng)層細(xì)胞制備

于細(xì)胞融合前-，準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞，常選用小鼠腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是: 一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死0亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成-的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)適宜，8周標(biāo)準(zhǔn)兔多抗制備佐劑，過少則不能提供雜交瘤細(xì)胞所需要的生長(zhǎng)因子，過多會(huì)阻礙雜交瘤細(xì)胞的貼壁，一般以鋪滿孔底 30% 為好。

雜交瘤細(xì)胞的篩選與克0隆

細(xì)胞融合后，培養(yǎng)于添加了 hat 的選擇培養(yǎng)基的 96 孔板中，培養(yǎng)-后半定量換液，培養(yǎng)基更換時(shí)應(yīng)注意輕緩，第 5 天能在顯微鏡下看到明顯的雜交瘤細(xì)胞克0隆，第 7 天左右，雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)至鋪滿孔底約 1 /10。此時(shí)進(jìn)行 elisa 檢測(cè)養(yǎng)心細(xì)胞孔。取細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì) mrj 融合蛋白進(jìn)行間接 elisa檢測(cè)，篩選出能分泌抗0體的雜交瘤細(xì)胞孔，有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行亞克0隆，經(jīng)過 3 次亞克0隆后，獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗 mrj 融合蛋白單克0隆抗0體的細(xì)胞株。對(duì)雜交瘤細(xì)胞株按從 96 孔板-24 孔板-10 cm 培養(yǎng)皿的順序擴(kuò)大培養(yǎng)，部分細(xì)胞用于腹0水制備單抗，部分細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br />

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